引物设计原则（同源臂引物设计原则）

引物设计原则

2.设计引物需要考虑的参数

引物设计原则（同源臂引物设计原则）

引物是决定PCR反应成败的最重要因素之一。

引物设计主要考虑因素为：特异性和扩增效率。

a.特异性是由错配的频率决定。特异性差的引物易产生不需要的扩增产物。

b.扩增效率是指引物以每循环增加两倍扩增产物的最优能力。

3.计算引物的Tm值

引物用Tm值来评价DNA-DNA杂交链稳定性，引物设计原则，引物设计原则，过高的退火温度会导致引物-模板杂交不足，导致PCR产物产率低，而退火温度过低可能导致非特异性产物扩增。

不超过20个碱基的引物Tm值计算使用如下Wallace法则：Tm=2℃(A+T)+4℃(G+C)

超过20个碱基的引物Tm值计算可使用引物设计软件，比如Primer3。

4.引物使用原则

同源臂引物设计原则

3.设计引物需要考虑的因素

引物是决定PCR反应和克隆反应成败的最重要因素之一。在基因克隆的引物设计及DNA片段的扩增阶段，与常规PCR相同。差异在于载体末端和引物末端应具有15～25nt同源序列，由此得到的PCR产物两端分别带上15～25个与载体序列同源性的碱基。

Ø特异性是由错配的频率决定。特异性差的引物易产生不需要的扩增产物。

Ø扩增效率是指引物以每循环增加两倍扩增产物的最优能力。

Ø重组效率指成功获得含有插入片段的克隆概率。

引物设计

单插入片段引物设计公式：

5’-上游载体末端同源序列+酶切位点（可删除）+目的基因特异性正向配对序列-3’

5’-下游载体末端同源序列+酶切位点（可删除）+目的基因特异性反向配对序列-3’

引物设计原则和注意事项

本指导原则旨在指导注册申请人对胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（高通量测序法）注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。

本指导原则是针对该类试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，引物设计原则，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，引物设计原则，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。