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更新时间:2025-11-09
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选择41例肺结核患者(TB)为实验组(其中19例为涂阳患者,超微量分光光度计,22例为凃阴患者),同时选择35例健康人群(HD)为对照组。采集外周抗凝血利用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),提取总RNA,超微量分光光度计,利用TaqMan探针qPCR技术检测miRNA-150在各组人群中的相对表达量,以RNU6B作为内参基因。实验方法:(1)样本采集,采集两组研究对象的外周血5ml,肝素锂抗凝,标本采集后12h内,采用密度离心法,离心参数为930xg,15min进行PBMC的分离,分离出PBMC后计数。(2)miRNA提取,采用OMEGA公司E.Z.N.AmiRNAKit试剂盒从PBMC中提取总的RNA(严格按照试剂盒说明书进行),用超微量分光光度计(美国安捷伦科技有限公司)测定RNA的质量及浓度,并于-80℃保存。(3)TaqManqPCR技术测定miRNA-150的表达,使用美国ABI公司的TaqManMicroRNAAssays探针进行qPCR测定miRNA的相对表达量。首先利用TaqMan®MicroRNAReverseTranscriptionKit将RNA反转录成cDNA,然后进行qPCR扩增,反应体系如下:TaqManUniversalPCRMasterMixⅡ7.5μL,TaqManSmallRNAAssay0.75μL,cDNA2.0μL,ddH2O4.75μL。反应条件为:95℃,15s,60℃,60s,40个循环。采用荧光定量PCR中的相对定量法,以RUN6B作为内参,以2-△△Ct计算miRNA-150相对表达量。
实验仪器与软件。Eppendorf常温离心机(5424,德国),Eppendorf低温离心机(5407,德国),IMPLEN超微量分光光度计(P330,德国),荧光定量PCR仪(ABI7500,美国),便携式光合测量系统(Li-6400,LI-COR,Nebraska,美国)等;7500Softwarev2.0.6(AppliedBiosystems,美国),Office2010(Microsoft,美国),BD8.10软件(Premier,加拿大),R3.2.3等。
▲图中为测定白桦无性系幼苗的苗高
2.2实验方法
1)光合指标的测定。于2015年6月9日上午9:00—10:0测定叶片的光合参数。每个白桦无性系选取3株生长正常的幼苗,每株选择2片完全伸展、长势良好的健康成熟叶片进行测量,重复3次。测定时人工光照的光合有效辐射为1000μmol/(㎡.s)。测定指标分别为净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO₂浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr),同时计算瞬时水分利用效率(EWUE=Pn/Tr)和羧化效率(ECUE=Pn/Ci)。
荧光分光光度计采用双单色器、带激发光监视系统的比例双光路设计,150W氙灯、优异的机械结构和数字化信号处理保证仪器可在1分钟内完成三维全谱高速扫描,产品体积小巧,专业、人性化的软件设计包含多种分析功能,丰富的附件大大扩展仪器的应用范围,可支持液态、粉末、薄膜样品的测量,超微量分光光度计,轻松满足在材料研究、药品分析、生化及临床检验、水质分析控制、食品安全检测(乳制品、维生素C、硒、黄曲霉毒素)等领域的定性定量分析需求。
荧光分光光度计主机特点:
1、单色器采用世界上先进的Czerny-Turner设计,具有1.5、2.5、5、10、20nm可调狭缝和10nm圆形狭缝。狭缝采用水平透过方式,相对于传统的竖直狭缝,被激发和产生发射的样品体积更大,灵敏度提高5~30倍,而所需的溶液体积更小,只需要40ul就可满足测量需要(检出限:<10pM荧光素),超微量分光光度计,标准池的检出限为:<1.0pM荧光素。
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