牛津杯法抑菌试验（牛津杯法抑菌试验原理）

各位老铁们好，相信很多人对牛津杯法抑菌试验都不是特别的了解，因此呢，今天就来为大家分享下关于牛津杯法抑菌试验以及牛津杯法抑菌试验原理的问题知识，还望可以帮助大家，解决大家的一些困惑，下面一起来看看吧！

本文主要内容一览

• 1、为什么各牛津杯中的加液量必须一致液面高度相同培养时为什么用陶瓷皿盖
• 2、利用牛津杯法测定化学消毒剂时微生物生长的影响影响以菌圈大小的因素有哪些
• 3、牛津杯为什么叫牛津杯呢
• 4、牛津杯抑菌实验的历史由来
• 5、耐药试验简介

牛津杯法抑菌试验（牛津杯法抑菌试验原理）

1为什么各牛津杯中的加液量必须一致液面高度相同培养时为什么用陶瓷皿盖

2.1牛津杯加液量的影响

对于大多数抗生素测定，都需要把牛津杯加满，虽然牛津杯加液量越大，所形成的抑菌圈直径就越大，但作者在多次试验中发现，若加满牛津杯，很容易使液体从中溢出，影响试验，同时扩散24 h后牛津杯内仍有少量的残留溶液，因此作者认为0.2 mL的加液量比较合适，而且每次重复效果好。

2.2平板预先扩散处理的影响

从图I可以看出在冰箱中扩散2 4h比不扩散的抑菌效果明显增加，使得三个抑菌圈之间重叠，可能有两个原因:第一，冰箱放置一夜，使菌液充分扩散到培养基中;第二，由于冰箱温度为3-4 9C，在一定程度上抑制了的生长繁殖，而此对抑菌作用有正向协同效果。

2.3益生菌菌悬液浓度的影响

牛津杯法进行抑菌试验时，控制检测平板中菌悬液的浓度非常重要，过浓则抑菌作用不明显，过低则菌体生长稀疏，抑菌圈边缘不清晰，难以准确测量。图2可以看出10-倍稀释液比10.4倍稀释液、10-z倍稀释液效果好，10一倍稀释液的菌悬液细胞浓度为105 CFU/mL0

2.4结论与讨论:为了得到清晰抑菌圈，牛津杯中的加液量为0.25 ml.、在3-4℃中扩散24 h，益生菌菌悬液用10-3倍稀释，使菌悬液细胞浓度为105CFU/mL。该种方法是利用益生菌培养上清液在琼脂培养基内的扩散作用，产生对益生菌的抑菌圈。当牛津杯内加人含有抑菌物质的上清液后，抑菌物质就随溶剂向培养基内呈球形扩散，将培养基平板置培养箱中培养，益生菌开始繁殖，抑菌物质在琼脂培养基中的浓度，随离开牛津杯的距离增大而降低，当扩散到一定时间后，这是琼脂培养基中抑菌物质的浓度恰好高于该抑菌物质对益生菌的最低抑菌浓度，益生菌的繁殖被抑制而呈现出透明的抑菌圈，在抑菌圈的边缘处，琼脂培养基中所W抑菌物质的浓度即为该菌悬液中对该种益生菌的最低抑菌浓度。进行该试验时，要在相同的条件下进行，这样才能较准确对比抑菌物质的抑菌效果。

牛津杯法抑菌试验（牛津杯法抑菌试验原理）

2利用牛津杯法测定化学消毒剂时微生物生长的影响影响以菌圈大小的因素有哪些

因素有以下三种：

1、消毒剂在机制中的扩散速率

2、消毒剂初始浓度

3、菌对消毒剂的敏感程度

抑菌圈大小只能在一定程度上反应杀菌能力差异,但不能准确反映.

3牛津杯为什么叫牛津杯呢

牛津杯采用优质的不锈钢制成，主要是作为琼脂扩散使用，它的两端平整光滑，结合性好，不易变形。利用有一定体积的不锈钢制的小管(牛津杯)，将抗生素溶液装满小杯，并在含有敏感试验菌的琼脂培养基上进行扩散渗透，经过一定时间后，抗生素扩散到适当的范围，产生透明的抑菌圈。抑菌圈的半径与抗生素在管中的总量(单位)、抗生素的扩散系数(cm2/h)、扩散时间(即抗生素溶液注入钢管至出现抑菌圈所需的时间)、培养基的厚度(mm)和低抑菌浓度(u/mL)等因素有关。抗生素总量的对数和抑菌圈直径的平方呈直线关系。因此，抗生素效价可以由抑菌圈的大小来衡量。

将培养基平板置培养箱中培养，一方面试验菌(指示菌)开始生长繁殖；另一方面抗生素呈球面扩散，形成递减的梯度浓度，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。在牛津杯周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度(药敏实验)或药物对指示细菌的抑菌程度(抑菌试验)。抗生素浓度越高，抑菌圈越大。具体操作如下：

1.倒底层平板：将灭菌的琼脂水底层培养基加热融化后，冷凉至55～50℃左右，倾倒入培养皿制成底层平板，将圆形小管竖直立在已经凝固的不含营养物质的琼脂凝胶平板(下层板)上。

2.制备混菌上层平板：将检测用上层培养基加热融化后，冷凉至55℃左右，上层培养基加入指示菌，轻轻摇匀。在每一培养皿底层平板上加入上层培养基，凝固后成上层平板备用。也就是这一过程中向圆形小管周围倒入混有指示菌的培养基(上层板)，待培养基*凝固后用镊子将圆形小管取出。

3.用移液器向牛津杯制造的小孔中分别加入待测物和对照液，培养一段时间后，测量小孔周围抑菌圈的大小，可反映出待测菌抑菌活性的大小。

4牛津杯抑菌实验的历史由来

牛津杯法又称杯碟法，在超净工作台中，将特定的微生物均匀涂于平皿培养基中。之后将已灭菌的牛津杯（内径6nm、外径8nm、高10nm的圆形小管）置于试验平板中，轻轻加压，使其与培养皿接触无空隙。往牛津杯中注入一定量的待测样品，请勿外溢。培养一段时间后测定抑菌圈的大小。

牛津杯法

由于待测样的抑菌效果不同，因此抑菌圈的大小也会不同。与纸片扩散法不同的是，待测物的有效成分是通过琼脂慢慢扩散出去，因此在比较抑菌圈时，要考虑培养皿中琼脂平板的厚度。

5耐药试验简介

耐药试验简称药敏试验（或药物敏感试验）。旨在了解病原微生物对各种抗生素的敏感（或耐受）程度，以指导临床合理选用抗生素药物的微生物学试验。一种抗生素如果以很小的剂量便可抑制、杀灭致病菌，则称该种致病菌对该抗生素“敏感”。反之，则称为“不敏感”或“耐药”。为了解致病菌对哪种抗菌素敏感，以合理用药，减少盲目性，往往应进行药敏试验。其大致方法是：从病人的感染部位采取含致病菌的标本，接种在适当的培养基上，于一定条件下培养；同时将分别沾有一定量各种抗生素的纸片贴在培养基表面（或用不锈钢圈，内放定量抗生素溶液），培养一定时间后观察结果。由于致病菌对各种抗生素的敏感程度不同，在药物纸片周围便出现不同大小的抑制病菌生长而形成的“空圈”，称为抑菌圈。抑菌圈大小与致病菌对各种抗生素的敏感程度成正比关系。于是可以根据试验结果有针对性地选用抗生素。近年已有自动化的药敏试验仪器问世，使试验更加迅速、准确。目前滥用抗生素，致使抗药菌增加，甚至因长期大量使用广谱抗生素，杀伤体内正常微生物，失去微生物的相互制约作用，从而使一些少见的或一般情况下的非致病菌大量繁殖，引起所谓“二次感染”的情况屡有发生，给治疗造成人为的困难。因此，提倡使用药敏试验，坚持合理用药十分重要。

该法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，二抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关。

稀释法药敏试验可用于定量测试抗菌药物对某一细菌的体外活性，分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。实验时，抗菌药物的浓度通常经过倍比（lg2）稀释，能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度成为最小抑菌浓度（MIC），一个特定抗菌药物的测试浓度范围应该包含能够检测细菌的解释性折点（敏感、中介和耐药）的浓度，同时也应该包含质控参考菌株的MIC.

首先制备含抗菌药物的琼脂稀释平板。再接种待测菌株，然后是结果判读。

普通营养琼脂培养基：可去生化试剂店购买，做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基，如做大肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦糠凯培养基。做沙门氏菌可选择血清培养基。

购买或自制（详见实验准备）

待做药敏试验的细菌

接种环、酒精灯、打孔器、牛津杯、移液器、滴头

药敏片的准备：购买或自制

制备方法：取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅1520分钟高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。

抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25毫升，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。切勿受潮，置阴暗干燥处存放，有效期36个月。

药液的制备（用于商品药的试验）：按商品药的使用治疗量的比例配制药液；如商品药百病消按其说明量治疗量0.01%饮水，可按这个比例配制药液，可取10毫克加入10毫升的水中混匀。此稀释液即为用于做药敏试验的药液。

在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密）

将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片），每种药敏片的名称要记住。

将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密。）

以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（内径6nm、外径8nm、高10nm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，并在小管处标记各种药物名称。每个平板可放46支小管。待分钟后，分别向各小管中滴加一定数量的各种药液，勿使其外溢。置37℃培养818小时，观察结果。

将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

该法较简单，成本低，易操作，比较适用于商品药物的检测。

在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密。）

以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（以防药液渗漏，影响结果）。

加样：按不同药液加样，样品加至满而不溢为止。

将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。过夜培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。

药敏实验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。

表1药物敏感实验判定标准

抑菌圈直径（毫米）敏感度

20以上极敏

15~20高敏

10~14中敏

10以下低敏

0不敏

药物敏感实验判定标准参考表

1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上为高敏，6—9毫米为低敏，无抑菌圈为不敏。

应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度合适（约56mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基1820ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。

细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。

药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。

一般培养温度和时间为37℃818小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4℃冰箱内2~4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。