细胞复苏步骤（干式细胞复苏仪）

本篇文章给大家谈谈细胞复苏步骤，以及干式细胞复苏仪对应的知识点，文章可能有点长，但是希望大家可以阅读完，增长自己的知识，最重要的是希望对各位有所帮助，可以解决了您的问题，不要忘了收藏本站喔。

本文主要内容一览

• 1、细胞壁多少温度融化
• 2、细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项
• 3、心肺复苏的步骤是怎样的
• 4、细胞培养换液传代冻存复苏操作说明

细胞复苏步骤（干式细胞复苏仪）

1细胞壁多少温度融化

细胞一般储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

细胞复苏就是要把原本冷冻保存(冻存)着的细胞恢复到一般的生长状态，今天我们来看看原代细胞的复苏步骤。

一、检查

收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即处理告诉寄方。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于–70 °C，隔夜后，移到液氮罐保存)。

二、冷冻细胞解冻

方法一：

1、准备好37度水浴锅，预热至37度；

2、准备好T25培养瓶，加入10ml完全培养基（培养基量必须大于冻存液10倍体积）；

3、取出冻存细胞管，用一次性PE手套包裹冻存管（防止管内进水导致污染），迅速放于水浴锅内，于1min内融化完全；

4、取出冻存管，酒精喷洒消毒后擦干，置于超净台内；

5、吸取冻存管内细胞悬液，加入步骤2中准备好的T25培养瓶内，8字缓慢摇匀；

6、培养瓶放于37度CO2恒温培养箱内，静置培养24h，更换新鲜换培养基（注意贴壁细胞、悬浮细胞不同操作方法）。

方法二：

1、准备好37度水浴锅，预热至37度；

2、准备好15ml无菌离心管，加入10ml完全培养基（培养基量必须大于冻存液10倍体积）；

3、准备好实验用培养板或培养器皿；

4、取出冻存细胞管，用PE手套包裹冻存管（防止管内进水导致污染），迅速放于水浴锅内，于1min内融化完全；

5、取出冻存管，酒精喷洒消毒后擦干，置于超净台内；

6、吸取冻存管内细胞悬液，加入步骤2中准备好的15ml无菌离心管，轻轻吹打混匀；

7、将离心管内细胞悬液，按实验需求接种于实验器皿内（注意接种密度不低于2×104/cm2），放于37度CO2恒温培养箱内，静置培养24h，更换新鲜换培养基（注意贴壁细胞、悬浮细胞不同操作方法）。

细胞复苏步骤（干式细胞复苏仪）

2细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项

一、细胞复苏

将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移人15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。

加入10mlDMEM培养基清洗，弃上清液。加入10mlDMEM完全培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5%CO2的细胞培养箱中培养。

二、细胞传代

细胞密度达到80%~90%时．去培养基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加人1mlDMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。

加入10mlPBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。再加入10mlPBS（经高压灭菌，保存于40C），吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×106/盘接种，在含5%CO2的细胞培养箱继续培养。

三、细胞冻存

细胞密度达到80%～90%时，去培养基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加入lmlDMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10mlPBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。

加入lml冻存液（90%血清，10%DMSO），放入冻存盒内（盒内有异丙醇，以保证温度降低的速度），立即放入一80℃冰箱内，过夜，第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。

冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

注意事项

（1）进入细胞间开始细胞培养时，必须严格按照下列步骤操作：

①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。

②确定衣服的袖口已经卷起或者白大褂的袖口已经扎紧。

③确定酒精灯内的酒精量，需要的话及时进行补充。

④确定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。为了方便单手开启瓶盖，实验开始前可以把所有瓶盖旋松。

⑤尽量不要直接倾倒溶液，除非瓶口没有被烧坏。如果倾倒失败，溶液粘在瓶口，请用喷过75%酒精的纸巾仔细清洁瓶口周围（不要接触到瓶口）后在火焰上简单烧灼。

⑥操作时如果不能肯定所用的耗材是洁净的，必须及时更换。

⑦实验完毕及时收拾，保持工作区域清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。

（2）细胞污染的预防

①实验用品防止污染。细胞培养所用试剂、耗材、器材的清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌要仔细，并在无菌实验检测阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁、消毒、灭菌。

②操作过程防止污染。

③穿着容易起静电或吸附灰尘的衣物必须更换为白大褂后才能进入细胞间。

④实验开始前需要确定戴的手套没有问题，只要接触过生物安全柜之外的物品，必须及时对手套进行消毒。

⑤进入细胞培养间后关好门，坐下来尽量少走动以免影响生物安全柜的风帘。工作开始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶盖。事先要严格检查所用的器材、溶液和细胞，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大规模污染。

⑥细胞操作时动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口放在火焰周围简单转动烧灼，注意不要让火焰把塑料瓶口烧化。

⑦实验操作时生物安全柜的隔板要尽可能放低，尽量减少谈话，打喷嚏或咳嗽时绝对不能对着工作区，以免造成不必要的污染。

⑧瓶盖应当倒放在远离自己的地方，以避免瓶盖被误操作所污染。

⑨不要从敞开的容器口上方经过，以避免衣服上掉落不明物体对细胞的污染。

⑩实验操作时要注意及时更换巴斯德吸管、移液枪枪头和移液管，切勿一根管子做到底。一旦发现接触了非洁净或者无法确定洁净的物品必须直接丢弃。实验完毕应及时收拾，保持实验室清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。

（3）防止细胞交叉污染

①在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好作上标记便于辨别。按顺序进行操作，一次只处理一种细胞，多种细胞多种操作一起进行时易发生t昆乱。

②在进行换液或传代操作时，粘有细胞的移液枪头和移液管不要触及试剂瓶瓶口，以免把细胞带到培养基中污染其他细胞。

③所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，必须及时保种冻存，一旦发生污染可重新复苏细胞，继续培养。

扩展资料：

细胞培养（cellculture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。

不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。

细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。

参考资料：百度百科：细胞培养

3心肺复苏的步骤是怎样的

心肺复苏的步骤：第一时间进行胸外按压，按压的部位为男性是双乳头连线中点，女性选择胸骨的中下1/3交界处。要开放气道，使患者处于仰卧位，立即清理口腔内的异物。进行人工呼吸，周围有除颤仪，则需要第一时间进行电除颤的治疗。

心搏骤停是指各种原因引起的、在未能预计的情况和时间内心脏突然停止搏动，从而导致有效心泵功能和有效循环突然中止，引起全身组织细胞严重缺血、缺氧和代谢障碍，如不及时抢救即可立刻失去生命。心搏骤停不同于任何慢性病终末期的心脏停搏，若及时采取正确有效的复苏措施，病人有可能被挽回生命并得到康复。

心肺复苏的步骤：

1、进行胸外按压，对于发生急性呼吸心跳骤停的患者，不论其原因是什么都要第一时间进行胸外按压，按压的部位为男性是双乳头连线中点，女性选择胸骨的中下1/3交界处，按压频率为100-120次/min，按压深度是成年男性大约为5-6cm，儿童要求胸廓前后径的1/3，胸外按压的要点是快速、用力、不间断。

2、开放气道，使患者处于仰卧位，通过压额抬颌的办法使得颈部气道尽量开放，随即立即清理口腔内的异物，包括痰液与假牙。第三，要进行人工呼吸，胸外按压与呼吸频率要按照30:2的比例进行。如果周围有除颤仪，则需要第一时间进行电除颤的治疗，而不必等待胸外按压等操作的循环完成。

心搏骤停一旦发生，如得不到即刻及时地抢救复苏，4～6min后会造成患者脑和其他人体重要器官组织的不可逆的损害，因此心搏骤停后的心肺复苏必须在现场立即进行，为进一步抢救直至挽回心搏骤停伤病员的生命而赢得最宝贵的时间。

4细胞培养换液传代冻存复苏操作说明

所需试剂

细胞完全培养基：★ 推荐使用海星生物细胞配套专用培养基

1. 细胞处理后的第二天，在显微镜下观察细胞状态，如死细胞较多且细胞密度较低，需要进行换液操作。

（1）悬浮细胞请在高倍镜下观察，一般而言，活细胞轮廓圆润、界限清晰、透明度大、折光性强。如细胞活率较高，则继续正常培养。

（2）贴壁细胞如观察到较多细胞漂浮，请在高倍镜下观察，判断漂浮着的细胞是死细胞还是暂未贴壁的活细胞。如细胞活率较高，则继续正常培养。

（3）半贴壁细胞正常培养会有部分细胞漂浮，属正常现象。请在高倍镜下观察，判断漂浮着的细胞是否是死细胞。如细胞活率较高，则继续正常培养。

2. 如需换液，参考以下步骤：

（1）悬浮细胞：收集培养容器中的所有细胞悬液。250 g离心4 min后弃去上清。使用预热的完全培养基重悬，将细胞悬液接种到合适的培养容器中。

（2）贴壁细胞：直接弃去培养容器中的上清，添加预热的完全培养基至原培养容器中。

（3）半贴壁细胞：收集培养容器上清中的所有细胞，250 g离心4 min后弃去上清。使用预热的完全培养基重悬，接种至原培养容器中。

3. 之后，每2~3天更换一次完全培养基，后续根据细胞生长密度和状态传代或冻存。

注意: 若发现异常情况，应及时排查原因，并与我们联系。

所需试剂

细胞完全培养基

贴壁和半贴壁细胞需要同时准备以下试剂：

0.25% Trypsin-0.04% EDTA（货号: GUTP-R001，以下简称胰酶）

1×PBS（货号: GUPB-R001，以下简称PBS）

1. 预热完全培养基（贴壁和半贴壁细胞还需要预热胰酶和PBS）。

2. 细胞收集。

（1）悬浮细胞直接收集培养容器中的所有细胞悬液至离心管中。

（2）贴壁/半贴壁细胞需要对细胞进行消化处理，步骤如下：

①用PBS洗涤细胞2次。洗涤过程中注意动作轻柔，清洗全面。

贴壁细胞直接弃去培养容器中的培养上清。用PBS洗涤细胞2次，洗涤后的PBS直接弃去，无需保留。

半贴壁细胞需收集培养容器中的培养上清至离心管中。用PBS洗涤细胞2次，洗涤后的PBS需收集至离心管中。

② 加入胰酶，迅速铺匀，确保其充分接触细胞表面。

③显微镜下观察消化情况，约70%~80%细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养容器底面。立即加入胰酶双倍体积的完全培养基，轻摇培养容器，使培养基和胰酶迅速混匀，终止消化。

④吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来。将细胞悬液转移至离心管中。

3. PBS洗涤培养容器1~2次，收集所有细胞悬液至离心管中。

4. 收集的所有细胞悬液250 g离心4 min。

5. 离心后去除上清。加入2 mL预热的完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。

6. 将细胞按(2.5~4.0) ×10^4个活细胞/cm2接种至适宜的培养容器内。

注意: 如未计数，也可按照适宜比例进行传代，但请根据细胞实际生长情况灵活调整传代比例。

7. 摇匀细胞，将培养容器放入细胞培养箱中。

8. 后续根据细胞生长密度和状态进行补液（悬浮细胞）/换液（贴壁/半贴壁细胞）、传 代或冻存等操作。

所需试剂

冻存液

★ 推荐使用海星HyCyte一步冻存液（即用型、无血清、无需程序降温）

1. 待细胞生长至可传代的密度，即可准备冻存。

2. 消化细胞，取少量细胞悬液计数。细胞悬液经250 g离心4 min。

3. 离心后去除上清，用适量4℃预冷的冻存液重悬细胞。将细胞按比例或数量分装至冻 存管中。一般冻存密度为(1.0~2.0)×10^6个/mL。

注意:细胞长时间在非培养条件下放置会严重影响细胞的状态。如离心后用冻存液重悬计数，请 将细胞放置于4℃冰箱内，以减弱细胞代谢，较好的保持细胞状态。

4. 如使用海星一步冻存液，冻存管直接竖直放入-80℃冰箱即可完成“一步”冻存。如使用程序冻存液，需将冻存管放入提前预冷的程序降温盒后放入-80℃冰箱。

5. 24小时后可将冻存管转移到液氮进行长期保存。

注意:细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。建议24 h后尽快转移至液氮中。

所需试剂

细胞完全培养基

★ 推荐使用海星生物细胞配套专用培养基

1. 开启37℃水浴锅。预热完全培养基，提前将细胞从液氮中取出，放于-80℃冰箱，让冻存管中液氮挥发。

2. 洁净工作台内准备15 mL离心管，加入5 mL预热的完全培养基。

3. 从-80℃冰箱中取出细胞。快速将冻存管置于37℃水浴锅内，快速晃动，使冻存液迅速融化。

注意:① 融化过程必须晃动冻存管，保证冻存液融化均匀。晃动时应避免水没过管盖增加污染风险。

②管内冻存液融化至只剩一个约2mm直径的冰晶时，可停止水浴。继续晃动冻存管至冰晶融化。

4. 用75%酒精消毒冻存管表面。在洁净工作台内小心开盖，尽量避免气泡溢出，轻柔吹打数次， 转移至预先准备的离心管内。用少量完全培养基洗涤冻存管1~2次，一并收集至离心管内。

5. 250 g离心4 min。离心后去除上清。加入2 mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分 吹散、混匀。（如有台盼蓝可取少量细胞悬液进行染色计数）

6. 将细胞平均接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养容器中，加入足量完全培养基， 摇匀细胞，将培养容器放入培养箱中培养。

7. 复苏次日，观察细胞状态并换液，具体操作见”细胞换液”。

注意:贴壁/半贴壁细胞接种24 h内不应扰动。部分细胞贴壁较慢，复苏后48 h不应扰动，具体注 意事项见相应细胞说明书。

细胞处理原则

· 严格的无菌环境。务必保证实验室、超净台/生物安全柜和培养箱的清洁。

· 规范的操作方式。请按照操作说明描述的方式操作，注意操作细节。

· 需要合适的、质量可靠的实验耗材和试剂。使用的试剂必须经验证可靠，适宜细胞生长且批间差异小。