六一电泳槽（六一电泳）

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本文主要内容一览

• 1、牛肉高温下氨基酸会破坏营养吗
• 2、昆虫基因组提取的原理是

六一电泳槽（六一电泳）

1牛肉高温下氨基酸会破坏营养吗

：以牛背最长肌为研究对象，对其进行高温处理（110、115、121 ℃分别加热3、6、9、12、15 min），通过分析蛋白质化学键、傅里叶变换红外光谱、紫外光谱、内源荧光光谱以及蛋白质片段大小等结构信息变化，探讨高温处理对牛肉蛋白质化学作用力及肌原纤维蛋白结构的影响。结果表明，随着处理温度的升高和加热时间的延长，牛肉蛋白中离子键和氢键含量显著下降（P＜0.05），疏水相互作用和二硫键含量显著升高（P＜0.05）。肌原纤维蛋白二级结构发生重排，N—H和C—N伸缩振动以及N—H弯曲振动较为明显。高温处理促使芳香族氨基酸残基暴露于分子表面，并改变了肌原纤维蛋白质疏水区域的局部结构和蛋白质的三级结构。此外，在高温处理下肌原纤维蛋白发生了明显的降解聚集，并形成了大量小分子质量的蛋白片段。可见，高温处理能够显著改变牛肉蛋白质的化学作用力及肌原纤维蛋白的结构，本研究为高温处理下牛肉蛋白质变化机制的研究提供参考。

关键词：高温处理；牛肉蛋白质；化学作用力；肌原纤维蛋白结构

高温肉制品（如酱牛肉等）是指加热介质温度高于100 ℃（通常为115～121 ℃）、中心温度高于115 ℃并恒定适当时间的肉制品，具有营养卫生、食用方便、携带方便等特点，深受消费者喜爱[1]。加热是肉制品加工过程中最重要的工艺之一，而热加工过程中肌肉蛋白质分子间化学作用力和结构的变化对肉制品的最终品质起着重要影响[2]。李蕙蕙[3]研究发现，在鸡肉火腿肠加工过程中，随加热温度的升高，鸡胸肉盐溶蛋白溶液的疏水相互作用先剧烈上升后稳步回落，加热到80 ℃时，盐溶蛋白中210、96.5 kDa及小分子质量蛋白的电泳带全部消失。邓丽等[4]研究了鲍鱼热加工过程中蛋白间作用力及其质构特性，结果发现随温度升高，蛋白二级结构发生明显变化，各化学作用力与蛋白凝胶质构特性具有高度相关性。刘海梅等[5]研究发现，在鲢鱼鱼糜凝胶形成过程中，采用40 ℃和90 ℃两段加热，鲢鱼肌球蛋白的α-螺旋结构部分转变成β-转角和无规卷曲结构，以无规卷曲结构为主，其中α-螺旋和无规卷曲结构是维持鲢鱼鱼糜凝胶网络结构的主要蛋白质构象。张莉莉[6]的研究发现，随着处理温度（100～121 ℃）的升高，鱼糜凝胶中蛋白质二级结构无规卷曲被破坏，离子键和疏水相互作用剧烈下降，而氢键和二硫键整体呈上升的趋势。

国内外对肉制品在热加工过程中蛋白质间化学作用力和结构变化的研究多集中在火腿肠、鱼糜等方面，并且通常在100 ℃以下，而对牛肉高温肉制品的研究较少。本实验以不同高温处理的牛背最长肌为研究对象，采用化学法并结合傅里叶变换红外光谱、紫外光谱、内源荧光光谱以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE），研究高温处理对蛋白质间化学作用力和结构的影响，以期为进一步分析高温处理过程中牛肉蛋白质变化的机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选取来自河南伊赛牛肉股份有限公司宰杀的18 月龄夏洛莱牛公牛6 头，屠宰前禁食、禁水12 h。每头牛经击晕、宰杀、放血、去头蹄内脏、剥皮、劈半、冲洗后，胴体吊挂排酸3 d，选取牛背最长肌作为样品。

氯化钠、尿素、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、溴化钾、溴酚蓝、异丙醇、乙酸、磷酸（均为分析纯） 天津市德恩化学试剂有限公司；丙烯酰胺、四甲基乙二胺（tetramethylenediamine，TEMED）、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、β-巯基乙醇、SDS 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

FJ-200高速分散均质机 上海标本模型厂；H1650高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；DYCZ-24DN垂直电泳槽、DYY-6C型稳压稳流型电泳仪北京市六一仪器厂；Gel-Doc-XR+凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；TYAIB型高压蒸汽灭菌锅 宁波久兴医疗器械有限公司；VERTEX70型傅里叶变换红外光谱仪德国Bruker公司；UV2600紫外-可见分光光度计 日本Shimadzu公司；Cary eclipse型荧光分光光度计 美国Aglient公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉样品的预处理及高温处理

生鲜牛背最长肌顺着肉样纹理将其肉眼可见的表面脂肪、夹层脂肪剔除干净，并修整切割成大小均匀的方形肉块（5 cm×5 cm×1 cm），用蒸煮袋真空密封包装，随后放入高压蒸汽灭菌锅中进行高温处理。参考张莉莉[6]的方法，高温处理条件为：高压蒸汽灭菌锅压力0.12 MPa，当温度达到（110±1）、（115±1）℃和（121±1）℃后分别保持3、6、9、12、15 min，高温处理后的牛肉样品静置冷却后放在4 ℃冰箱冷藏室待测。

1.3.2 肌原纤维蛋白的提取

参照Xiong Youling L.等[7]的方法并作适当修改，准确称取5.000 0 g处理过的肉样，以未处理（0 min）的样品为对照，加入10 倍体积分离缓冲液A（0.1 mol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸、0.5 mmol/L二硫苏糖醇、10 mmol/L K2HPO4，pH 7.0），10 000 r/min均质1 min后80 目纱布过滤，滤液10 000 r/min冷冻离心10 min，取沉淀，重复3 次。沉淀再加入4 倍体积分离缓冲液B（0.1 mol/L NaCl、1 mmol/L NaN3，pH 6.25），10 000 r/min冷冻离心10 min，弃上清液取沉淀，重复3 次，沉淀即为肌原纤维蛋白。

1.3.3 化学作用力的测定

参考Gómez-Guillén等[8]的方法，准确称取1 g处理后的肉样，以未处理（0 min）的样品为对照，分别加入10 mL 0.05 mol/L NaCl（SA）、0.6 mol/L NaCl（SB）、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素（SC）、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素（SD）、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+1.5 mol/L β-巯基乙醇（SE），10 000 r/min均质1 min后于4 ℃条件下静置2 h，然后10 000 r/min冷冻离心10 min，取上清液。采用Lowry法测定上清液中蛋白质的含量。离子键的含量以溶解于SB与SA的蛋白质含量之差表示；氢键的含量以溶解于SC与SB的蛋白质含量之差表示；疏水相互作用的含量以溶解于SD与SC的蛋白质含量之差表示；二硫键的含量以溶解于SE与SD的蛋白质含量之差表示。离子键的相对含量以离子键的含量与所有化学作用力的含量之和的比来计算，氢键、疏水相互作用、二硫键相对含量的计算方法与之相同。

1.3.4 肌原纤维蛋白傅里叶变换红外光谱分析

准确称取1 mg不同温度处理的肌原纤维蛋白，以未处理（0 min）的样品为对照，加入100 mg KBr研磨压片，采用傅里叶变换红外光谱仪对样品在400～4 000 cm-1范围内进行全波数扫描，仪器分辨率为5 cm-1，扫描信号累加64 次。

1.3.5 肌原纤维蛋白紫外吸收光谱分析

不同温度处理的肌原纤维蛋白用10 mmol/L pH 7的磷酸盐缓冲液配制成1 mg/mL的蛋白溶液，以10 mmol/L pH 7的磷酸盐缓冲液作为空白，以未处理（0 min）的样品为对照，进行紫外光谱扫描，扫描速率10 nm/s，扫描波长范围200～600 nm。

1.3.6 肌原纤维蛋白内源荧光光谱分析

不同高温处理下的肌原纤维蛋白用10 mmol/L pH 7的磷酸盐缓冲液配制成1 mg/mL的蛋白溶液，以10 mmol/L pH 7的磷酸盐缓冲液作为空白，以未处理（0 min）的样品为对照，采用荧光分光光度计进行荧光光谱扫描，激发波长为295 nm，发射波长300～400 nm，扫描范围300～500 nm，激发和发射狭缝宽度均为5 nm。

1.3.7 肌原纤维蛋白SDS-PAGE分析

采用Laemmli[9]的电泳体系，参考姜启兴[10]的方法并做适当修改，样品质量浓度1 mg/mL，分离胶质量分数为12%，浓缩胶质量分数为5%。

1.4 数据统计分析

每次实验做3 次平行，结果用表示，采用SPSS 19.0软件进行数据分析，数据统计方法采用ANOVA进行LSD差异分析，P＜0.05表示差异显著。使用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 牛肉蛋白质化学作用力的变化

由表1可见，离子键相对含量在加热初期与生鲜样品（0 min）相比显著下降（P＜0.05），并随着加热时间的延长呈不断下降的趋势，但在加热后期变化不显著（P＞0.05）。在110、115 ℃和121 ℃加热15 min后离子键相对含量分别下降了71.3%、88.4%和92.2%。氢键相对含量随着加热时间延长呈急剧下降的趋势，但在加热中期（6～9 min）变化不显著（P＞0.05）。121 ℃加热3 min后，氢键相对含量比110、115 ℃下降幅度高，达到57.8%；说明加热温度越高，氢键出现断裂的时间点越早。结果表明随着温度升高，离子键、氢键发生了断裂，相对含量减少。离子键和氢键是相对于疏水相互作用和二硫键较弱的键合力，在加热初期就能被破坏，而在加热后期无明显变化[11]。

表1 不同处理温度和时间对牛背最长肌蛋白质间化学作用力的影响

Table1 Effects of temperature and heating time on chemical forces of beef longissimus dorsi muscle proteins

六一电泳槽（六一电泳）

2昆虫基因组提取的原理是

利用改进的CTAB 法提取昆虫全基因组DNA。

主要试剂

1. 蛋白酶K[美国Merck公司]

2. 三羟甲基氨基甲烷(Tris)[美国Amresco公司]

3. Taq DNA聚合酶及dNTP[NEB公司]

4. 琼脂糖及溴化乙锭(EB)[美国Amresco公司生产]

5. 乙二胺四乙酸钠(Na2EDTA)[美国Amresco公司]

6. 苯酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇等[国产分析纯]

7. 电泳缓冲液TBE：浓贮存液5×TBE：54.0 g Tris碱，57.1 g硼酸，20 ml 0.5 M EDTA，pH=8.0，加蒸馏水定容至1 L，工作液为稀释的0.5×TBE

主要设备

1. 高速冷冻离心机(3K-30)[德国Sigma公司]

2. 恒温水浴锅[北京六一仪器厂]

3. 电泳仪[美国Bio-Rad公司]

4. 水平电泳槽[美国Bio-Rad公司]

5. 凝胶成像系统(Gel Doc EQ)[美国Bio-Rad公司]

6. 4℃、-20℃冰箱[日本Sanyo公司]

7. 紫外分光光度计(Beckman Du 650)[日本Sanyo公司]

8. 高压灭菌锅[日本Sanyo公司]

实验材料

烟粉虱成虫

实验步骤

改进的CTAB 法提取昆虫全基因组DNA:

1. 加入 50 L TE 缓冲液，充分悬浮细胞样品；

2. 加入 60 L 10% SDS 溶液，10 L 20 mg/mL 蛋白酶K，温和混匀，37℃温育 1 h；

3. 加入 100 L 5 mol/L 的 NaCl 溶液，上下颠倒离心管十多次，充分混匀；

4. 加入 80 L CTAB/NaCl 溶液，温和混匀，65℃下温育 10 min；

5. 加入 700 L 氯仿/异戊醇，温和混匀，12000 r/min 高速离心 2 min；

6. 吸取上清至另一干净离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀，12000 r/min 高速离心 2 min；

7. 吸取上清至另一干净离心管，加入 2 倍体积冰冷的无水乙醇沉淀 DNA，温和混匀；

8. 离心（12000 r/min，30 min，4℃），彻底去除上清；

9. 用 300 L 70% 预冷的乙醇洗涤沉淀，离心（12000 r/min，15 min，4℃），弃上清，再离心几秒，用移液器彻底除去酒精，风干；

10. 沉淀溶于 100 L TE 溶液中，-20℃保存；

11. 以紫外分光光度法和 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 浓度和质量。

DNA的浓缩与纯化：

1. 将样品置于 1.5 mL 离心管中，在每一样品中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液，将管中样品振荡混合成乳状液体；

2. 室温下，12000 r/min 离心 1 min；

3. 吸取上层水相层到另一洁净的离心管中，再次加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液，混匀，室温下 12000 r/mi n离心 1 min；

4. 吸取上层水相转移到另一洁净离心管中，加入等体积的水饱和乙醚，混匀，静置 5 min 待有机相与水相分层，弃上清乙醚；

5. 置于 68℃温育 10 min，不时用手指弹动管壁，使乙醚充分挥发；

6. 加入 1/10 体积的乙酸钠溶液（3 mol/L，pH5.2），上下颠倒离心管使溶液充分混匀；

7. 准确加入 2 倍体积的预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，-20℃静置 1 h使 DNA 充分沉淀；

8. 4℃，12000 r/min 离心 10 min，弃上清；

9. 加入 70% 预冷的乙醇至管中 2/3 体积，混匀漂洗以去除残余的盐，高速离心（4℃，12000 r/min，5 min），弃尽上清；

10. 室温放置 15 min 左右，使乙醇完全挥发，加入适当体积的双蒸水或 TE 溶液重溶 DNA 沉淀。