流体剪切应力通过（流体剪切应力方向）

机械负荷已被证明可以调节骨重塑和体内平衡。流体剪切应力（FSS）是机械刺激的一种形式，可以激活许多信号通路并促进成骨细胞增殖和分化。以往研究表明，生理性FSS（12dyn/cm2）可通过ERK5/AP-1，Gαq/ERK5和NFATc1/ERK5信号通路促进MC3T3-E1成骨细胞的增殖作用，通过ERK5-AKT-FoxO3a-Bim/FasL信号通路抑制MC3T3-E1成骨细胞的凋亡作用。

流体剪切应力通过（流体剪切应力方向）

MiRNAs已被证明参与调节骨形成。此外，一些miRNAs在成骨细胞增殖和分化过程中对机械刺激敏感，几种miRNAs已被证实参与调节成骨细胞凋亡，如miR-148a，miR-182-5p和miR-543。Mai等人证明miR-34a下调可促进FSS下的成骨细胞分化。然而，miR-34a是否能调节FSS下成骨细胞的增殖和凋亡，以及可能的机制还有待探索。

越来越多的证据表明，长链非编码RNAs（lncRNAs）通过与miRNAs的竞争性结合来调控靶基因。LncRNAs也可调节成骨分化，例如，lncRNAMSC-AS1通过miR-140-5p促进成骨分化。作为复杂的lncRNA-miRNA-mRNA调控网络的一部分，lncRNAs可影响骨质疏松症患者的骨形成和骨吸收。然而，lncRNAs在FSS下成骨细胞中的作用尚不清楚。

基于此，甘肃省兰州大学第二医院骨科的课题组曾研究了miR-34a在FSS下是否能调控成骨细胞增殖和凋亡及其可能的机制。研究结果揭示了lncRNATUG1/miR-34a/FGFR1轴在FSS调控的成骨细胞增殖和凋亡中的关键作用，并可能建立针对骨质疏松症的潜在治疗策略。相关内容发表在JournalofCellularandMolecularMedicine杂志题为“FluidshearstressregulatesosteoblastproliferationandapoptosisviathelncRNATUG1/miR-34a/FGFR1axis”。

首先，mimic-34a和inhibitor-34a分别用于上调和下调MC3T3-E1细胞中miR-34a的水平。EdU实验和CCK-8实验结果显示，上调miR-34a可抑制细胞增殖，而下调miR-34a可促进细胞增殖。接下来，评估了miR-34a对成骨细胞凋亡的影响。流式细胞分析显示，mimic-34a转染可显著增加细胞凋亡率。Hoechst染色也表明，miR-34a的上调促进了细胞凋亡。这些数据表明，miR-34a的下调促进了成骨细胞的增殖并抑制了细胞的凋亡。

qRT-PCR结果表明，miR-34a在FSS下持续下调，并在60min时达到

zui;di水平

（图1A）。之前的研究表明，FSS促进成骨细胞增殖并抑制成骨细胞凋亡。为了研究miR-34a是否参与FSS调节的成骨细胞的增殖和凋亡，先使用mimic-34a转染MC3T3-E1细胞，然后将FSS（12dynes/cm2）作用于细胞0、30、60或90min。结果表明，mimic-34a转染可显著抑制FSS对细胞增殖的促进作用（图1B-D）。另一方面，流式细胞分析显示，mimic-34a转染可减弱FSS对成骨细胞凋亡率的降低作用（图1G）。这些结果表明，FSS对miR-34a的下调促进了成骨细胞的增殖并抑制了成骨细胞的凋亡。

图1FSS下调miR-34a表达水平，miR-34a上调削弱FSS下成骨细胞增殖和凋亡的改变。

接下来，为了研究FGFR1在成骨细胞增殖和凋亡中的功能，使用pcDNA3.1-FGFR1过表达MC3T3-E1细胞中的FGFR1，siRNA-FGFR1敲低MC3T3-E1细胞中的FGFR1。结果显示，pcDNA3.1-FGFR1转染可促进细胞增殖，而siRNA-FGFR1转染可抑制细胞增殖。此外，流式细胞分析显示，与阴性对照相比，siRNA-FGFR1转染组的凋亡率明显上调。Hoechst染色也显示，FGFR1沉默促进成骨细胞凋亡。

为了确定FGFR1是否介导miR-34a调控的成骨细胞的增殖和凋亡，将mimic-34a和pcDNA3.1-FGFR1共转染到MC3T3-E1细胞中。结果表明，过表达miR-34a可抑制细胞增殖，而共转染mimi-34a和pcDNA3.1-FGFR1可减弱这种抑制作用（图2A、B）。共转染mimic-34a和pcDNA3.1-FGFR1可部分逆转由上调miR-34a引起的PCNA、CDK4和CyclinD1的mRNA和蛋白质的下调作用（图2C、D）。此外，与mimic-34a转染组相比，mimic-34a和pcDNA3.1-FGFR1共转染组的细胞凋亡率更低（图2E）。Hoechst染色也表明，尽管mimic-34a可促进细胞凋亡，但pcDNA3.1-FGFR1可抑制这种影响（图2F）。蛋白质印迹进一步证实，pcDNA3.1-FGFR1可减弱由miR-34a上调引起的Bax和cleavedcaspase-3的增加，以及Bcl-2的降低（图2G）。这些结果表明，miR-34a至少部分通过调节MC3T3-E1细胞中的FGFR1发挥了抗增殖和促进凋亡作用。

图2FGFR1介导miR-34a调节的成骨细胞增殖和凋亡。

然后，实验通过TargetScan和StarBase数据库预测miR-34a的靶基因。其中主要关注FGFR1，它是已报到参与调控成骨细胞增殖和凋亡的FGFR家族成员之一。为了验证miR-34a是否可直接靶向FGFR1，构建了荧光素酶报告载体（WT和MUT）。数据表明，FGFR1是miR-34a的直接靶点。

为了确认FSS对FGFR1表达水平的影响，将FSS作用于MC3T3-E1细胞1小时。qRT-PCR和蛋白质印迹证实，FSS可显著增加FGFR1的mRNA和蛋白质表达水平。此外，mimic-34a仅可抑制FSS上调的FGFR1蛋白质表达水平，而对FSS上调的FGFR1mRNA表达水平几乎没有影响。上述结果表明，在FSS下，miR-34a靶向MC3T3-E1细胞中的FGFR1。

此外，LncRNAs通常可作为ceRNAs通过竞争性结合miRNAs来调节靶基因表达。为了确认miR-34a是否受lncRNA调控，使用StarBase数据库预测了可以与miR-34a相互作用的lncRNAs。在许多潜在靶点中，可参与调节成骨细胞增殖和分化作用的lncRNATUG1是一个重要的靶点。

为了研究FSS对lncRNATUG1表达水平的影响，将FSS（12dynes/cm2）作用于MC3T3-E1细胞0、30、60或90min。qRT-PCR结果表明，FSS可显著上调MC3T3-E1细胞中lncRNATUG1的表达水平（图3A），进一步分析证实lncRNATUG1定位在细胞质和细胞核中（图3B）。然后，发现miR-34a的上调可显著抑制lncRNATUG1的表达（图3C），敲低lncRNATUG1可显著增加miR-34a的表达（图3D）。为了验证lncRNATUG1是否可直接与miR-34a相结合，构建了荧光素酶报告载体（WT和MUT）（图3E）。结果显示，上调miR-34a可减弱WTlncRNATUG1荧光素酶活性，下调miR-34a可增强WTlncRNATUG1荧光素酶活性，但对MUTlncRNATUG1的荧光素酶活性没有影响（图3F）。这些结果表明，LncRNATUG1和miR-34a相互作用并相互抑制。

图3LncRNATUG1和miR-34a相互作用并相互抑制。

最后，通过lncRNATUG1过表达和敲除实验，验证了lncRNATUG1对成骨细胞增殖和凋亡的调控作用。结果表明，lncRNATUG1的过表达促进了成骨细胞增殖。相反，lncRNATUG1敲低抑制成骨细胞增殖。流式细胞分析表明，沉默lncRNATUG1可提高细胞凋亡率。Hoechst染色也显示siRNA-TUG1转染促进细胞凋亡。

接下来，确认了lncRNATUG1是否调节FGFR1的表达。蛋白质印迹显示，lncRNATUG1的过表达显著增加FGFR1水平。相反，lncRNATUG1敲低抑制了FGFR1蛋白的表达。此外，siRNA-TUG1和inhibitor-34a在FSS作用前共转染到MC3T3-E1细胞中，结果显示，inhibitor-34a转染部分逆转了FSS下siRNA-TUG1诱导的FGFR1蛋白质表达水平的降低作用。这些结果表明，lncRNATUG1通过靶向miR-34a/FGFR1通路促进FSS下成骨细胞的增殖并抑制其凋亡。

图4LncRNATUG1/miR-34a/FGFR1轴在成骨细胞中的作用示意图。在FSS作用下，MC3T3-E1成骨细胞中miR-34a的表达水平下调，并可与上调的lncRNATUG1相互作用。MiR-34a的下调可通过靶向FGFR1促进成骨细胞的增殖作用并抑制成骨细胞的凋亡作用。

总之，该研究证明了miR-34a在成骨细胞中响应FSS而下调。miR-34a的下调通过靶向FGFR1促进成骨细胞增殖并抑制成骨细胞凋亡。此外，lncRNATUG1通过吸附miR-34a上调FGFR1的表达，从而促进成骨细胞增殖，抑制成骨细胞凋亡（图4）。因此，研究结果揭示了lncRNATUG1/miR-34a/FGFR1轴在FSS调控的成骨细胞增殖和凋亡中的作用，并可能为骨质疏松症提供有希望的治疗策略。参考文献：WangX,HeJ,WangH,ZhaoD,GengB,WangS,AnJ,WangC,HanH,XiaY.FluidshearstressregulatesosteoblastproliferationandapoptosisviathelncRNATUG1/miR-34a/FGFR1axis.JCellMolMed.2021Sep;25(18):8734-8747.doi:10.1111/jcmm.16829.Epub2021Aug5.PMID:34350720;PMCID:PMC8435422.

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