线粒体复合体Ⅰ试剂盒说明书微量法（线粒体复合体v）

规格：

管

/96

线粒体复合体Ⅰ试剂盒说明书微量法（线粒体复合体v）

样

线粒体复合体

Ⅰ

试剂盒说明书

微量法

正式测定前务必取

个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

复合体

Ⅰ

（

EC1.6.5.3

）又称

NADH-CoQ

还原酶或

NADH

脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从

NADH

传递给

CoQ

，同时可使

O

2

还原生成

2.-

，是呼吸电子传递链上产生

2.-

的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（

）状态，而且可以反映活性氧（

ROS

）生成状态。

测定原理

复合体

Ⅰ

能够催化

NADH

脱氢生成

NAD

+

，在

下测定

NADH

的氧化速率计算出该酶活性的大小。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计

酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿

/96

孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一：液体

瓶，

-20℃

保存；

试剂二：液体

瓶，

-20℃

保存；

试剂三：液体

瓶，

-20℃

保存；

试剂四：液体

瓶，

-20℃

保存；

试剂五：液体

支，

-20℃

保存；

试剂六：粉剂

×1

支，

-20℃

保存，用时加入

2mL

蒸馏水，现配现用。

工作液的配制：临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解；现配现用；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

①

准确称取

0.1g

组织或收集

500

万细胞，加入

1mL

试剂一和

10uL

试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②

将匀浆

600g

，

4℃

离心

5min

。

③

弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，

11000g

，

4℃

离心

10min

。

④

上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体

Ⅰ

（此步可选做）。

⑤

步骤

④

中的沉淀即为线粒体，加入

200uL

试剂二和

2uL

试剂三，超声波破碎（冰浴，功率

20

％或

200W

，超声

3s

，间隔

10

秒，重复

30

次），用于复合体

Ⅰ

酶活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热

30min

以上，调节波长至

340nm

，蒸馏水调零。

2、样本测定

（

）工作液于

37℃

（哺乳动物）或

25℃

（其它物种）孵育

5min

。

（

）在微量石英比色皿或

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孔板中加入

10μL

样本、

200μL

工作液和

15μL

试剂六，混匀，记录

340nm

处初始吸光值

A1

和

2min

后的吸光值

A2

，计算

ΔA=A1-A2

。

复合体

Ⅰ

活力单位的计算

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

（

）按蛋白浓度计算

单位的定义：每

组织蛋白每分钟消耗

1nmolNADH

定义为一个酶活力单位。

复合体

Ⅰ

活力（

nmol/min/mgprot

）

=[ΔA×V

反总

÷

（

ε×d

）

×10

9

]÷(V样

×Cpr)÷T

=1808×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（

）按样本鲜重计算

单位的定义：每

组织每分钟消耗

1nmolNADH

定义为一个酶活力单位。

复合体

Ⅰ

活力（

nmol/min/g

鲜重）

=[ΔA×V

反总

÷

（

ε×d

）

×10

9

]÷(W×V样

÷V

样总

)

÷T=365×ΔA÷W

（

）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每

万个细菌或细胞每分钟消耗

1nmolNADH

定义为一个酶活力单位。

复合体

Ⅰ

活力

(nmol/min/10

4

cell)=[ΔA×V反总

÷

（

ε×d

）

×10

9

]÷(500×V样

÷V

样总

)÷T=0.73×ΔA

V反总：反应体系总体积，

2.25×10

-4

L；

ε

：

NADH

摩尔消光系数，

6.22×10

3

L/mol/cm；

d

：比色皿光径，

1cm

；

V

样：加入样本体积，

0.01mL

；

V

样总：加入提取液体积，

0.202mL

；

T

：反应时间，

2min

；

W

：样本质量，

g

；

500

：细胞或细菌总数，

500

万。

b.使用

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孔板测定的计算公式如下：

（

）按蛋白浓度计算

单位的定义：每

组织蛋白每分钟消耗

1nmolNADH

定义为一个酶活力单位。

复合体

Ⅰ

活力（

nmol/min/mgprot

）

=[ΔA×V

反总

÷

（

ε×d

）

×10

9

]÷(V样

×Cpr)÷T

=3616×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（

）按样本鲜重计算

单位的定义：每

组织每分钟消耗

1nmolNADH

定义为一个酶活力单位。

复合体

Ⅰ

活力（

nmol/min/g

鲜重）

=[ΔA×V

反总

÷

（

ε×d

）

×10

9

]÷(W×V样

÷V

样总

)

÷T=730×ΔA÷W

（

）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每

万个细菌或细胞每分钟消耗

1nmolNADH

定义为一个酶活力单位。

复合体

Ⅰ

活力（

nmol/min/10

4

cell）

=[ΔA×V

反总

÷

（

ε×d

）

×10

9

]÷(500×V样

÷V

样总

)÷T=1.46×ΔA

V反总：反应体系总体积，

2.25×10

-4

L；

ε

：

NADH

摩尔消光系数，

6.22×10

3

L/mol/cm；

d

：

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孔板光径，

0.5cm

；

V

样：加入样本体积，

0.01mL

；

V

样总：加入提取液体积，

0.202mL

；

T：反应时间，

2min

；

W

：样本质量，

g

；

500

：细胞或细菌总数，

500

万。

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