感受态细胞的制备（感受态细胞的制备注意事项）

大家好，今天给各位分享感受态细胞的制备的一些知识，其中也会对感受态细胞的制备注意事项进行解释，文章篇幅可能偏长，如果能碰巧解决你现在面临的问题，别忘了关注本站，现在就马上开始吧！

本文主要内容一览

• 1、制备感受态细胞的关键是什么
• 2、buffer缓冲液感受态细胞制备的作用
• 3、感受态细胞的制备时有什么注意事项
• 4、如何制备大肠杆菌感受态细胞
• 5、感受态细胞的制备和转化中为什么要加两次Cacl2Cacl2为什么要预冷

感受态细胞的制备（感受态细胞的制备注意事项）

1制备感受态细胞的关键是什么

制备感受态细胞的关键是将外源DNA分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。

主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。

扩展资料

制作方法

CaCl2法

1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞

细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。

联合其它的二价金属离子（如Mn、Co）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000倍。

2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。

电转法

电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。

参考资料来源：百度百科-感受态细胞

感受态细胞的制备（感受态细胞的制备注意事项）

2buffer缓冲液感受态细胞制备的作用

1缓冲液是一种能在加入少量酸或碱时抵抗pH改变的溶液.PH缓冲系统对维持生物的正常pH值,正常生理环境起重要作用.多数细胞仅能在很窄的pH范围内进行活动,而且需要有缓冲体系来抵抗在代谢过程中出现的pH变化.在生物体中有三种主要的pH缓冲体系,它们时蛋白质、重碳酸盐缓冲体系.每种缓冲体系所占的分量在各类细胞和器官中是不同的2感受态细胞制备：所谓感受态是指受体细胞处于容易吸收外源 DNA 的一种生理状态，可以通过物理与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞一般是限制一修饰系统( Restriction - Modification ）缺陷的变异株，以防止对导入的外源 DNA 的切割，用符号 RM 表示。其基本原理是：细菌处于0℃的CaC1，低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒 DNA 形成抗 DNase 的羟基﹣钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经

3感受态细胞的制备时有什么注意事项

感受态细胞的制备时的注意事项：

1、培养温度。较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了Inoue的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。

2、在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。

3、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。

4、冻存的感受态用一次拿一管，不要反复冻融。化冻之后立即使用，不要冰上放太久。

5、操作时可以轻弹轻甩，尽量避免用移液器吹吸。

扩展资料：

感受态细胞（competentcell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。

主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。

将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。

参考资料来源：百度百科--感受态细胞

4如何制备大肠杆菌感受态细胞

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

准备：

一.材料

E.coli DH5α菌株:Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA:购买或实验室自制,eppendorf管.

二.设备

恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光光度计,微量移液枪.

三.试剂

1.LB固体和液体培养基

2.Amp母液

3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板.

4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌,待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板.

5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌.

6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌.

操作步骤：

一、 受体菌的培养

从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期.将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右.

二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)

1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟.

2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟.

3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液.

4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年.

三、 转化

1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上.

2、 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后.

3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟.

4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr ).

5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时.

同时做两个对照:

对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同.此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现.

对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落.

四、 计算转化率

统计每个培养皿中的菌落数.

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下：

转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积

转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)

感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积

感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数

[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化.但它们的转化效率并不一定一样.有的转化效率高,需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率.

5感受态细胞的制备和转化中为什么要加两次Cacl2Cacl2为什么要预冷

感受态的制备,需要尽量排除杂质的污染,多次离心加CaCl2,只是为了使培养基尽量弃去.

感受态的整个制备过程都要求在冰上操作,CaCl2需要预冷是显然的操作,以最大限度保证细胞活性和转化效率.