免疫组化实验步骤（怎么看免疫组化结果）

大家好，感谢邀请，今天来为大家分享一下免疫组化实验步骤的问题，以及和怎么看免疫组化结果的一些困惑，大家要是还不太明白的话，也没有关系，因为接下来将为大家分享，希望可以帮助到大家，解决大家的问题，下面就开始吧！

本文主要内容一览

• 1、免疫组化实验需要几个样本
• 2、冰冻切片焦油紫染色法的实验原理
• 3、将鹅的肝脏冷冻切片并用什么染色液
• 4、免疫组化和westernblot有什么区别

免疫组化实验步骤（怎么看免疫组化结果）

1免疫组化实验需要几个样本

一、样本种类:

按来源:①组织;②培养细胞

按制作方式:①石蜡片(IHC-P)②冰冻片(IHC-F)③细胞片(ICC)

免疫组化荧光图

二、免疫组化流程图

免疫组化实验步骤解析01

取材

快:尽是半小时内取材完成

准:刀、剪锋利，一步到位，轻夹轻放

大小:1cmx1cmX02cm左右最宜

02固定

何时固定?

取材后立刻!马上!用什么固定?

4%多聚甲醛或福尔马林较通用，有致志外膜用Canov液，活检用Bouin液

固定液用多少?

组织体积20倍以上最宜。量少应中途换液1-3次固定多久?

6-24h最佳。固定后尽快包埋成蜡块(蜡块可保存几年时间而不影响实验结果)，固定越久所需修复强度越大，越容易出现自发荧光及非特异性染色。

03切片

要保存简单 --选石蜡片!要速度快

--选冰冻片!

要结构漂亮

--选石蜡片!

抗原不稳定 --选冰冻片!抗原稳定

--石蜡片冰冻片皆可!

04烤片切多厚?

石蜡片3-8um，一般5um;冰冻片5-15um，一般8um

石蜡片怎么捞片?

水温40-45℃组织平整后玻片有油漆的一面贴近组织向斜上方提起

烤多久?

37℃过夜或60℃1-2h

注意:使用防脱处理的玻片，冰冻片无需烤片

05

脱蜡至水

Step1:二甲苯(7min)

Step2:二甲苯(7min)

Step3:二甲苯(7min)

Step4:100%酒精(7min)

Step5:85%酒精(7min)

Step6:70%酒精(7min)

注:具体脱蜡时间可结合室温做调整，以组织上的石蜡脱干净为准。

06灭活

①一般组织使用3%HzO2室温孵育10min

内源性过氧化物酶在血管瘤肝胎盘、阑尾炎，坏死区域和急性炎症组织含量较高，这样的组织可以适当延长灭活时间

显色系统为过氧化物酶(HRP)系统，该步骤建议一定要做

碱性磷酸酶(AP)系统以及免疫荧光，该步可以不做

在灭活时，如组织片中出现细小且密集的气泡，表示过氧化物酶含量过高，这时用3%H2Oz溶液难以完全阻断，可以用0.5%高碘酸溶液室温条件孵育10min

07

抗原修复

抗原修复方式:

酶修复、高压热修复、微波热修复。微波热修复一般都能得到很好的效果

修复液的选择:

柠檬酸盐缓冲液(PH60)和EDTA(PH80或9.0)。经验证对于大多数的抗体来说后者使用效果更优

修复强度的选择:

固定时间越久，修复强度越强，旧标本修复强度强于新鲜标本

消化酶的使用:

不同的蛋白有最佳的消化酶，使用中要注意各种消化酶的最佳PH值

8封闭

05%BSA最常用

@血清，效果最全面

封闭血清与二抗同源(比如二抗是山羊抗小鼠gG，封闭液选择山羊血清)，与一抗不能同源09

抗体孵育

0单抗和多抗各有优势，按需选用

一抗4C孵育效果最佳，备选37℃1-2h

二抗需与一抗的种属、类别或亚类相匹配推荐护、山羊、绵羊等种属

0二抗/SABC一般37℃孵育30min10显色

0DAB显色液现用现配②建议镜下控制反应时间

根据显色时间的长短反向优化前期的实验条件

11

复染/返蓝

oMayerS苏木素复染(不易过染)

碱性溶液浸泡返蓝(如氨水、饱和磷酸氢二钠溶液等)

免疫荧光实验可选用DAPI等核染料复染细胞核，无需做返蓝

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脱水透明

Step1:70%酒精(3min)

Sted2:85%洒精(3min)

Step3:100%酒精(3min)

Step4:二甲苯(3min) Step5:二甲苯(3min) Step6:二甲苯(3min)

注:免疫荧光实验，该步骤可以不做。13

封片

①DAB显色用中性树胶封片

2免疫荧光建议用抗荧光衰减封片剂

AEC显色用水溶性封片剂

免疫组化实验步骤（怎么看免疫组化结果）

2冰冻切片焦油紫染色法的实验原理

冰冻切片焦油紫染色法的实验方法原理：冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。

实验材料：新鲜组织

试剂、试剂盒：H2O2酒精丙酮PBSDAPI工作液中性树上

仪器、耗材：OCT速冻架恒冷箱切片机烘箱荧光显微镜

实验步骤：

一取材

应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。

二速冻

1、将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。

2、如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。

3、当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。

4、在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。

5、若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。

三固定

1、样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。

2、取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。

3、组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min

四切片

1、恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。

2、切片时，低温室内温度以-15℃ ~ -20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。

3、切好室温放置30min后，入4℃丙酮固定5-10min，烘箱干燥20min。PBS洗5min×3。

4、进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5-10min，消除内源性过氧化物酶的活性。

五免疫荧光染色

1、冰冻切片室温晾干15min，可用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可不洗）。

2、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸）。

3、将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。

4、第二天先将湿盒放到37℃回温1h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗。

5、滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5min×3次。

6、滴加DAPI工作液染核，室温10-20min（工作浓度0.1%染色15min）。

7、回收DAPI，滴加5-10μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。

8、做好的切片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周左右。

转自病理人才汇

3将鹅的肝脏冷冻切片并用什么染色液

全部实验步骤

1取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时

230%蔗糖脱水48小时以上

3-25°C包埋(冰冻切片机内)

4 冰冻切片

冰冻切片步骤

冰冻切片免疫组化染色步骤：

冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟×2次，下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子)

你确定你是冰冻切片吗???

冰冻切片不能用热修复啊！！！

以下是我的步骤：

、冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3%过氧化氢孵育5~10分钟,PBS洗,5分钟×2。

25~10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

3PBS冲洗,5分钟×3次。

4滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。

PBS冲洗,5分钟×3次。

5滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

6PBS冲洗,5分钟×3次。

7显色剂显色(DAB)。

8自来水充分冲洗，复染，封片。

冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。此配方不易产生脱片。

配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O21ml，混匀后使用，每次新鲜配制。

冰冻切片免疫组化染色步骤

冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性.PBS洗，5分钟×2.

下接免疫组化染色操作步骤。

4免疫组化和westernblot有什么区别

1、原理不同：

免疫组化利用抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。

westernblot也是利用抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应。

2、组织定位不同：

免疫组化在组织定位和定性上比较准确，但是在定量上不够准确。westernblot因为有内参标定，所以在定量上要更加准确，但是在组织定位上不如免疫组化。

扩展资料：

一、免疫组化（SP法）操作步骤：

1、切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行。

2、缓冲液洗3min／2次。

3、为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在HydrogenPeroxideBlock中孵育10－15分钟。

4、缓冲液洗5min／2次。

5、滴加UltraVBlock，在室温下孵育5分钟以封闭非特异性的背景染色。

6、缓冲液洗5min／2次。

7、滴加一抗工作液37℃孵育1－2小时。

8、缓冲液洗5min／2次。

9、滴加PrimaryAntibodyEnhancer（增强子），在室温下孵育20分钟。

10、缓冲液洗5min／2次。

11、滴加HRPPolymer（酶标二抗），在室温下孵育30分钟。

12、缓冲液洗5min／2次。

13、向1mlDABPlusSubstrate（或AECPlusSubstrate）中滴加1－2滴DABPlusChromogen（或AECPlusChromogen），混匀后滴加到切片上，孵育3－15分钟。

14、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

二、westernblot操作步骤：

1、SDS－PAGE试剂：见电泳实验。

2、匀浆缓冲液：1．0MTris－HCl（pH6．8）1．0ml；10％SDS6．0ml；β－巯基乙醇0．2ml；ddH2O2．8ml。

3、转膜缓冲液：甘氨酸2．9g；Tris5．8g；SDS0．37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。

4、0．01MPBS（pH7．4）：NaCl8．0g；KCl0．2g；Na2HPO41．44g；KH2PO40．24g；加ddH2O至1000ml。

5、膜染色液：考马斯亮兰0．2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5％脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1．0g溶于20ml的0．01MPBS中。

6、显色液：DAB6．0mg；0．01MPBS10．0ml；硫酸镍胺0．1ml；H2021．0μl。